KLT (Kromatografi Lapis Tipis)

Pengertian KLT

Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran.
Kromatografi lapis tipis menggunakan fasa gerak berupa eluen, serta fasa diam berupa plat dengan lapisan adsorben yang tidak mudah bereaksi misalnya silika gel, aluminium oksida, atau selulosa.

Prinsip kerja
Prinsip dari KLT yaitu memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan.

Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.

Kegunaan
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas.

KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil.


Identifikasi pada KLT

Visualisasi
Proses identifikasi pada kromatografi lapis tipis dapat melalui visualisasi. Tahapan ini sangat penting karena diperlukan suatu keterampilan dalam memilih metode yang tepat karena harus disesuaikan dengan jenis sampel yang sedang di uji. Salah satu yang dipakai adalah penyemprotan dengan larutan ninhidrin.
Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione) adalah suatu larutan yang akan digunakan untuk mendeteksi adanya gugus amina. Apabila pada sampel terdapat gugus amina maka ninhidrin akan bereaksi menjadi berwarna ungu. Biasanya padatan ninhidirn ini dilarutkan dalam larutan butanol.

Nilai RF
Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu, diperlukan suatu perhitungan tertentu untuk memastikan spot yang terbentuk memiliki jarak yang sama walaupun ukuran jarak plat nya berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai Rf, nilai ini digunakan sebagai nilai perbandingan relatif antar sampel. Nilai Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf sering juga disebut faktor retensi. Nilai Rf dapat dihitung dengan rumus berikut :

       Rf = Jarak yang ditempuh substansi / Jarak yang ditempuh oleh pelarut
      
Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis.
       
Nilai Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa. Bila identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan, bila nilai Rfnya berbeda, senyawa tersebut dapat dikatakan merupakan senyawa yang berbeda. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0
Nilai RF yang baik berkisar antara 0,2 hingga 0,8.


Kromatogram/pola KLT
Pada pelaksanaannya, hasil dari KLT tidak hanya berupa satu noda. Namun dapat menghasilkan berbagai noda.
Maka dari itu tiap hasil klt memberikan pola tersendiri.
Untuk mengidentifikasi jenis fraksi yang dapat dimurnikan bisa dilihat dari pola KLT yang muncul, jika polanya mirip maka fraksi tersebut dianggap sama.


Fasa diam dan fasa gerak KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Fase diam-jel silika
Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.
Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus –OH.

Fasa gerak - Eluen
Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut.
Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan, tergantung pada:

  1. Kelarutan senyawa dalam pelarut. Tergantung pada besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
  2. Senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan jel silika.

Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat dibanding senyawa lainnya hanya dapat mengambil bagian interaksi van der Waals yang lemah. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan.

Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa dengan jel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari permukaan silika.

Penyerapan pada kromatografi lapis tipisbersifat tidak permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut.

Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.

Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik ketika anda membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu dengan baik termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut.


Informasi tambahan

Beberapa kelebihan KLT yaitu:

  1. KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis.
  2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
  3. Dapat dilakukan elusi secara mekanik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.
  4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
  5. Hanya membutuhkan sedikit pelarut.
  6. Biaya yang dibutuhkan terjangkau.
  7. Jumlah perlengkapan sedikit.
  8. Preparasi sample yang mudah
  9. Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan metode kertas tidak bisa (Gandjar dan Rohman, 2007).

Adapun kekurangan KLT  yaitu:

  1. Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak/noda yang diharapkan.
  2. Butuh sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok.
  3. Memerlukan waktu yang cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun


Adapun manfaat dari Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yaitu :

  1. Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian senyawa.
  2. Pemeriksaan simplisia hewan dan tanaman.
  3. Pemeriksaan komposisi dan komponen aktif.
  4. Penentuan kualitatif masing-masing senyawa aktif campuran senyawa.

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatrografi lapis tipis yang juga mempengaruhi harga Rf :

  1. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan
  2. Sifat dari penyerap dan derajat aktivitasnya.
  3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.
  4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak
  5. Derajat kejenuhan dari uap dalam mana bejana pengembangan yang digunakan
  6. Teknik percobaan, Arah dalam mana pelarut bergerak di atas plat.
  7. Jumlah cupilkan yang digunakan, Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan.
  8. Suhu, Pemisahan-pemisahan sebaiknya dilakukan pada suhu tetap,
  9. Kesetimbangan, Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam kromatografi, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam KLT :

  1. Lempeng yang akan digunakan harus diaktifkan terlebih dahulu agar pada proses elusi lempeng silica gel dapat menyerap dan berikatan dengan sampel. Pengaktifan lempeng dilakukan dalam oven pada suhu 110 C selama 30 menit.
  2. Chamber harus dijenuhkan untuk menghilangkan uap air atau gas lain yang mengisi fase penjerap yang akan menghalangi laju eluen.
  3. Pada saat penotolan, hendaknya sampel jangan terlalu pekat sebab pemisahannya akan sulit sehingga didapat noda berekor.
  4. Penotolan harus tepat sehingga didapatkan jumlah noda yang baik.
  5. Eluen yang digunakan harus murni sehingga tidak menghasilkan noda lain.

Noda-noda yang diperoleh biasanya berekor disebabkan karena :

  1. Penotolan yang berulang-ulang dan letaknya tidak tepat
  2. Kandungan senyawa yang terlalu asam atau basa
  3. Lempeng yang tidak rata
  4. sampel yang terlalu pekat

Subscribe to receive free email updates:

0 Response to "KLT (Kromatografi Lapis Tipis)"

Posting Komentar